近日，北京中醫藥大學(xué)東直門(mén)醫院科研團隊開(kāi)展的“通過(guò)網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)分析和體內外實(shí)驗探討雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎的機制”的研究成果正式在《Frontiers in Pharmacology》雜志（2022年影響因子/JCR分區；5.988/Q1）上發(fā)表。

▲ 圖 | 康臣玉林制藥雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎研究成果榮登《Frontiers in Pharmacology》雜志

研究背景

雞骨草膠囊內含三七、人工牛黃、豬膽汁、牛至、毛雞骨草、白芍、紅棗、梔子、茵陳等多種治肝養肝的優(yōu)質(zhì)中藥材，可疏肝利膽、清熱解毒，用于急、慢性肝炎和膽囊炎屬肝膽濕熱證者。另有臨床研究表明，雞骨草膠囊 可用于治療慢性乙型肝炎，但其產(chǎn)生療效的作用機制尚未完全闡明。該研究旨在通過(guò)網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)研究和體內、外實(shí)驗，探討雞骨草膠囊治療乙肝病毒感染的機制。

研究方法

本研究采用質(zhì)譜（MS）技術(shù)鑒定雞骨草膠囊的活性代謝物，并通過(guò)尾靜脈高壓水注射HBV復制質(zhì)粒建立HBV體內復制小鼠模型。使用脂質(zhì)體將質(zhì)粒轉染到細胞中，采用CCK-8試劑盒檢測細胞存活率，定量檢測HBV-s抗原（HBsAg）和HBV-e抗原（HBeAg）水平，qRT-PCR和Western blot分別檢測基因表達和蛋白表達；通過(guò)網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)研究獲得雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎的關(guān)鍵通路和關(guān)鍵基因。

▲ 圖 | 雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎的技術(shù)路線(xiàn)圖

研究結果

01 雞骨草膠囊及其含藥血清分別鑒定出92個(gè)和23個(gè)化合物，兩者成分進(jìn)行對比分析，推測7, 3’, 4’ -三羥基黃酮、膽酸和脫氧膽酸可能是其主要活性代謝物。

▲ 圖 | 雞骨草膠囊及其含藥血清的總離子色譜圖

02 動(dòng)物實(shí)驗結果顯示，雞骨草膠囊可降低HBV體內復制小鼠血清HBsAg水平。HE染色結果顯示，各組肝臟組織均無(wú)明顯損傷；免疫組化（IHC）結果顯示，雞骨草膠囊干預組的肝臟組織中HBsAg表達水平明顯降低。

▲ 圖 | 雞骨草膠囊加速HBV復制C57BL/6J小鼠血清和肝臟組織中HBsAg的消除

03 雞骨草膠囊可降低HepG2.2.15和HepAD38細胞上清液中HBsAg的水平和細胞中HBx的mRNA的表達，并可抑制HepG2.2.15和HepAD38細胞的增殖，而不影響HepG2和Huh7細胞的增殖。這表明，其可直接抑制細胞內HBV的復制，進(jìn)一步抑制HBV相關(guān)肝癌細胞的增殖。

▲圖 | 雞骨草膠囊體外抑制HBV的復制和HBV相關(guān)肝癌細胞的增殖

04 雞骨草膠囊可抑制HBV質(zhì)粒轉染Huh7和HEK-293T細胞中HBeAg的表達，同時(shí)抑制過(guò)表達HBx的Huh7和HEK-293T細胞的增殖。這表明，雞骨草膠囊可能依賴(lài)HBx基因的表達而抑制HBV的復制。

▲ 圖 | 雞骨草膠囊抑制HBx表達非肝細胞的增殖

05 根據對雞骨草膠囊的UHPLC-MS/MS分析，Swiss目標預測鑒定出663個(gè)靶基因，STITCH鑒定出292個(gè)靶基因。去除重復基因后，最終共鑒定出905個(gè)靶基因。利用維恩圖工具上傳雞骨草膠囊的潛在靶點(diǎn)和CHB的疾病靶點(diǎn)提取719個(gè)重疊基因（OEGs），網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)分析顯示雞骨草膠囊作用的關(guān)鍵基因主要是CASP3、CXCL8、EGFR、HSPA8、IL6、MDM2、MMP9、NR3C1、PTGS2等，這些基因之間存在一定關(guān)系。

▲ 圖 | 雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎的網(wǎng)絡(luò )藥理分析

06 KEGG富集分析表明，雞骨草膠囊潛在的靶基因主要與代謝途徑、癌癥途徑、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等相關(guān)，關(guān)鍵基因主要參與癌癥通路、膀胱癌中的microRNAs等。GO富集分析結果表明，雞骨草膠囊潛在靶基因的富集生物過(guò)程主要與信號轉導、蛋白磷酸化、氧化還原過(guò)程等相關(guān)，關(guān)鍵基因與多種GO- BP顯著(zhù)相關(guān)，包括凋亡過(guò)程的負調控、藥物應答、細胞增殖的正調控等?；谝陨习l(fā)現，癌癥、乙型肝炎、癌癥中的microRNAs、PI3K-Akt信號轉導和癌癥中的蛋白多糖的途徑都在潛在靶點(diǎn)和關(guān)鍵靶點(diǎn)中富集。由此推測，雞骨草膠囊可能調節了CHB相關(guān)的通路，這些生物過(guò)程和信號通路可能與雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎作用有關(guān)。

▲ 圖 | OGEs和關(guān)鍵基因的KEGG和BP功能富集

 研究結論

體內和體外實(shí)驗研究表明，雞骨草膠囊具有抑制HBV復制的作用，同時(shí)抑制HBV復制肝癌細胞系的增殖，其關(guān)鍵代謝產(chǎn)物為3’, 4’, 7-三羥基黃酮、膽酸和脫氧膽酸，作用機制可能與癌癥通路、乙型肝炎、癌癥中的microRNAs、PI3K-Akt信號通路和癌癥通路中的蛋白聚糖有關(guān)。本研究為雞骨草膠囊的臨床應用提供了更廣泛的證據支持。